”Night at the Museum – Yö Museossa” on huikea koko perheen seikkailuelokuva. Larry Daleylla (Ben Stiller) työpaikat ovat vaihtuneet tiuhaan. Hän päättää hankkia vakituisen työpaikan ollakseen parempi roolimalli pojalleen. Hän uskoo löytäneensä unelmatyön saadessaan yövartijan paikan Luonnon-historiallisessa Museossa. Työn erikoisuus paljastuu hänelle vasta yön tunteina, kun koko museo herää eloon. Larry joutuu keskelle kaaosta, jossa roomalaiset, mayat, dinosaurukset ja muut historian avainhenkilöt ottavat kilpaa toisistaan. Ainoa johon Larry voi tukeutua on Presidentti Rooseveltin vahanukke (Robin Williams), joka rientää ratsuineen apuun.